實驗方法原理

細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復(fù)蘇細胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。

實驗材料細胞

試劑、試劑盒D-Hanks液小牛血清培養(yǎng)液青霉素鏈霉素胰蛋白酶HClNaHCO3DMSO甘油

儀器、耗材微量加樣槍吸頭離心管凍存管槍頭膠塞移液管玻璃瓶紅血球計數(shù)板記號筆醫(yī)用橡皮膏移液槍超凈工作臺離心機恒溫水浴箱冰箱倒置相差顯微鏡培養(yǎng)箱液氮冰箱

實驗步驟

一、材料準備

1. 儀器：凈化工作臺、 離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

2. 玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、 培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。

3. 塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。

4. 其他物品：微量加樣槍、紅血球計數(shù)板、記號筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。

5. 試劑：D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油。

二、細胞凍存

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。

2. 取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中。

3. 離心1 000 rpm，5 min。

4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。

5. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。

6. 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。

7. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

三、 細胞復(fù)蘇

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。

2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。

3. 離心， 1 000 rpm，5 min。

4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

注意事項

1. 從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但最好為對數(shù)生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。

2. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。

3. 凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。

其他

一、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。

二、慢凍程序

1. 標準程序：采用細胞凍存器

當溫度在-25 ℃以上時， 1~2 ℃/min；

當溫度達-25 ℃以下時， 5~10 ℃/min；

當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中。

2. 簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。

3. 傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽長期儲存。

三、低溫保護劑的應(yīng)用

在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。

常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。

四、細胞凍存方法

1. 預(yù)先配制凍存液

（1）10%DMSO + 細胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

（2）10%甘油+ 細胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

2. 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液， 用吸管吹打制成細胞懸液（1×106 ~ 5 ×106細胞/ml）。

3. 加入1 ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存。

五、保存細胞的復(fù)蘇方法

1. 快速解凍

凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）。

2. 解凍后的細胞可直接接種到含生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。

3. 如果細胞對冷凍保護劑特別敏感

解凍后的細胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。